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Parte 3: Analisi filogenetica delle sequenze proteiche allineate
Descrizione
In questa parte dell’esercitazione, costruiremo un albero filogenetico delle 24 opsine. Per farlo, dovremo prima rimuovere i residui amminoacidici non conservati che abbiamo identificato facendo l’allineamento multiplo nella seconda parte dell’esercitazione.
Compito
Procedi secondo le seguenti istruzioni:
1. Modifica l’allineamento multiplo ottenuto nella seconda parte dell’esercitazione rimuovendo i residui non conservati
i. Torna alla finestra di JalView che contiene l’allineamento multiplo ottenuto durante la Parte 2 dell’esercitazione
ii. In JalView cancella tutti i gap o i residui che sembrano non conservati selezionando con il cursore l’area in alto sopra ai residui che vuoi eliminare (apparirà una casella rossa con una riga rossa sopra) e poi premendo cancella sulla tastiera (“backspace”, la freccia indietro ←)
iii. Salva l’allineamento modificato che hai ottenuto in formato FASTA: File > Output to Textbox > FASTA. Apri un nuovo file di testo sul tuo computer andando col cursore sul Desktop, click col tasto destro del mouse Nuovo > File di testo. Copia i dati di sequenza FASTA che hai appena prodotto dalla finestra e incollali nel nuovo file di testo. Lascia il file di testo aperto perché ci servirà ancora.
Nota: se per qualsiasi ragione, non sei riuscito a modificare l’allineamento o a salvarlo, non è troppo importante per questo esercizio. In questo esercizio abbiamo selezionato le sequenze in modo tale che producano un bell’albero filogenetico anche se non viene modificato troppo l’allineamento. (Tieni però conto che nella realtà, prima di creare un albero filogenetico bisogna sempre intervenire sull’allineamento e rimuovere le regioni non allineate!)
2. Per creare un albero filogenetico con le sequenze modificate, devi passare a MUSCLE l’allineamento modificato (formato del risultato “ClustalW”). Per farlo vai alla sezione “MUSCLE” e segui le istruzioni.
3. Cerca di rispondere alle domande della sezione “Domande”.
MUSCLE
1. Per creare un albero filogenetico con le sequenze modificate, copia il FASTA contenente l’allineamento modificato nella casella di ricerca (input box) di MUSCLE e lancia il programma (prima di cliccare su “Submit”, assicurati che “ClustalW” sia il formato di output selezionato).
2. Nella pagina dei risultati, clicca su “Send to ClustalW_Phylogeny” e in “Step 2″ sulla pagina di filogenesi di ClusalW seleziona come segue:
“Tree format”: Default; “Distance correction”: ON; “Exclude gaps”: ON (Questo è il passaggio più importante. Modificando le sequenze tu avrai rimosso le regioni che non combaciano. Tuttavia, se avessi lasciato qualche buco nell’allineamento, l’aver selezionato questa opzione farà si che il programma si occupi di far lavorare l’algoritmo solo sulle regioni appaiate senza buchi.) “Clustering method”: UPGMA; “P.I.M.”: ON
3. Ora clicca su “Submit”.
4. In fondo alla pagina dei risultati, sotto a “Phylogram”, troverai una rappresentazione grafica del tuo albero filogenetico. Puoi selezionare come lunghezza dei rami (branch length) il valore “Real” per vedere quanto velocemente si sono evolute le tue sequenze. Ad ogni modo, nell prossima parte dell’attività, la rappresentazione grafica del cladogramma sarà più a portata di mano. Guardando la struttura dell’albero cerca di rispondere ad alcune delle domande della sezione “Domande”.
Domande
1. Dai un’occhiata alla struttura dell’albero. Dovresti vedere una sequenza che fa gruppo a se rispetto a tutte le altre. Qual’è? Perchè pensi che sia proprio quella?
2. Il resto dell’albero divide le sequenze in due gruppi principali. Questa suddivisione in generale riflette le relazioni evolutive fra le specie? Vedi nessuna eccezione?
Ora puoi fare delle ulteriori analisi riguardo all’evoluzione delle opsine facendo un breve esercizio facoltativo (vai alla sezione “Compiti facoltativi”) oppure procedere con la parte 4 dell’esercitazione cliccando su link più sotto.
Compiti facoltativi
Ulteriori analisi dell’allineamento multiplo di sequenze
A questo punto abbiamo costruito un albero filogenetico delle protein opsine. In questa parte dell’esercitazione utilizzeremo l’allineamnto di più sequenze per ulteriori analisi dell’evoluzione delle opsine.
Compito
Torna all’allineamento multiplo di sequenze in JalView e, basandoti su quello che hai imparato dall’analisi filogenetica svolta nella parte 3 dell’esercitazione, raggruppa le sequenze secondo i gruppi che hai osservato nell’albero della parte 3 (il cladogramma). Puoi spostare le sequenze cliccando sul nome di ciascuna e usando le frecce su e giù nella tua tastiera. NOTA: ignora per questa analisi la sequenza Danio_mel_rec1A, mettila in cima, infondo o magari rimuovila completamente da JalView (la puoi eliminare cliccando sul nome della sequenza e premendo cancella “ <- “).
Domande
1. Nei recettori associate a protein G, una sequenza di tre residui che si trova subito dopo il dominio transmembrane importante per il legame con G-alpha. Riesci a trovare un tripeptide conservato che rifletta anche il raggruppamento delle sequenze?
2. Quale pensi che sia la ragione per cui questo tripeptide è così conservato?
Lista attivitá
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